灵芝，俗称灵芝草，古称瑞草、芝草、金草、神草等。是我国中草药宝库中的一种珍贵的药用真菌，历代医学家均认为灵芝是滋补强壮，扶本固正的名贵药品，经常服用有轻身延年之功效。目前野生灵芝产品较少，人工栽培周期长(2个月以上)，生产效率低，又受环境、区域、季节等限制，易遭病虫害，产量与质量不稳定[841，从而影响灵芝的开发生产。采用液体深层发酵法培养灵芝，周期短(l价12d)，成本低，产量大，质量稳定[8]s，同时液体培养为灵芝栽培提供菌种使生产原种和栽培种的时间大大缩短。本研究从经济有效角度出发，以菌丝体生物量为主要指标，结合发酵液多糖的含量，对灵芝深层发酵培养的营养条件及非营养条件进行系统地研究，为规模化、工厂化发酵或栽培提供有价值的试验依据。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1菌株灵芝5760由湖南农业大学食用菌研究所提供。
1.1.2培养基
斜面培养基配方马铃薯(去皮)20%，葡萄糖2%，琼脂2%，pH自然;
基础培养基配方葡萄糖1%，蔗糖2%，蛋白陈1%，酵母浸膏0.5%，EJJZP仇0.10%，MgSO40.05%;
1.2培养方法
1.2.1液体菌种制备将3块黄豆粒大小的菌块接到液体菌种培养基中，25OmL三角瓶的装液量IO0mL，于28OC，15oprm摇床培养gd。
1.2.2液体菌种营养条件的优化
1.2.2.1不同碳源对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响试验
分别以1%的不同碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、玉米粉、小麦粉、麦鼓粉)代替基础培养基中的碳源(葡萄糖1%、蔗糖2%)，其它成份不变，设不加碳源为对照。
1.2.2.2不同氮源对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响试验
在最适碳源1%浓度下，以1%不同氮源(蛋白陈、牛肉浸膏、黄豆饼粉、硝酸钾、硫酸钱、氯化钱)代替基础培养基中氮源(蛋白陈1%、酵母浸膏0.5%)，其它成份不变，ll设不加氮源为对照。
1.2.2.3无机盐对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响试验
在最适碳源1%和最适氮源1%下，不添加KHZP仇或MgSO;为对照，其它成份不变。
1.2..2.4多因素对灵芝菌丝体生物量的影响试验
根据单因素试验结果选取最适碳源，最适氮源，KHZpO4，MSgO;四因素设三水平。选择无交互作用的正交表肠(34)「86](表2一)l，进行液体菌种培养基优化试验。
表2-1正交试验因素与水平
1.2.3液体菌种发酵条件的优化
1..23.1初始pH对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响试验
以优化的培养基配方配制培养基，灭菌前用1mol几Hcl和1mo比Na0H调节pH值至4.5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和自然状态(5.64)，测定不同pH对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响
1.2.3.2不同装液量对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响试验
在优化培养基及适宜pH下，25omL三角瓶中装液量分别为60mL、80mL、10m0L、120mL、140mL，探讨装液量对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖影响。
1.2.3.3液体菌种培养的动态研究试验
在第4d、6d、sd、lod、12d、14d测定灵芝菌丝体生物量、pH、总糖、多糖、还原糖的变化。1.2.3.4种龄和接种量对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响试验
种龄设4d、6d、8d3水平，接种量设5%、10%、15%、20%4水平，观察接种量和种龄对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响。
1.2.4深层发酵条件的优化
1.2.4.1深层发酵培养的动态性研究试验
深层发酵培养基与液体菌种培养基相同，以液体菌种为d6种龄和10%接种量接种到深层发酵培养基中，分别培养ld、Zd、3d、4d、sd、6d、7d、sd 、gd钡组定各项指标。
1.2.4.2搅拌转速对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响试验
设搅拌转速为12oprm、150印m、180prm、210印m，观察对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响。矛
1.2.4.3分散剂对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响试验
以玻璃珠作为分散剂，设分散剂为5粒、10粒、15粒、20粒，观察对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响。
1.2.4.4消沫剂对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响试验
以豆油为消沫剂，分别添加0.10%、.020%、.030%、.040%，观察对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响。
1.2.5发酵罐培养研究
以种龄d610%的接种量接种于SL发酵罐装液量为ZL的培养基中，添加适宜消沫剂，观察灵芝菌丝体在发酵罐中生长的动态。
1.3测定方法
1.3.1菌丝体收集发酵液经两层纱布过滤，菌丝体经蒸馏水冲洗数次后，取菌丝于60℃干燥至恒重，电子天平称重菌丝体干重。
1.3.2pH测定用pH3一2型酸度计测定。
1.3.3多糖和总糖测定蕙酮一硫酸法18刀。
1.3.4还原糖测定DNS法[8gl
1.3.5氨基氮测定甲醛滴定法[99]。
1.3.6发酵液多糖的提取[56]发酵液于4000/r而n离心10而n，取上清液lmL，加2倍体积的95%乙醇，放入冰箱中醇析24h，得乳白色絮状沉淀，乙醇洗涤两次，干燥得灵芝发酵液多糖。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1菌株灵芝5760由湖南农业大学食用菌研究所提供。
1.1.2培养基
斜面培养基配方马铃薯(去皮)20%，葡萄糖2%，琼脂2%，pH自然;
基础培养基配方葡萄糖1%，蔗糖2%，蛋白陈1%，酵母浸膏0.5%，EJJZP仇0.10%，MgSO40.05%;
1.2培养方法
1.2.1液体菌种制备将3块黄豆粒大小的菌块接到液体菌种培养基中，25OmL三角瓶的装液量IO0mL，于28OC，15oprm摇床培养gd。
1.2.2液体菌种营养条件的优化
1.2.2.1不同碳源对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响试验
分别以1%的不同碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、玉米粉、小麦粉、麦鼓粉)代替基础培养基中的碳源(葡萄糖1%、蔗糖2%)，其它成份不变，设不加碳源为对照。
1.2.2.2不同氮源对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响试验
在最适碳源1%浓度下，以1%不同氮源(蛋白陈、牛肉浸膏、黄豆饼粉、硝酸钾、硫酸钱、氯化钱)代替基础培养基中氮源(蛋白陈1%、酵母浸膏0.5%)，其它成份不变，ll设不加氮源为对照。
1.2.2.3无机盐对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响试验
在最适碳源1%和最适氮源1%下，不添加KHZP仇或MgSO;为对照，其它成份不变。
1.2..2.4多因素对灵芝菌丝体生物量的影响试验
根据单因素试验结果选取最适碳源，最适氮源，KHZpO4，MSgO;四因素设三水平。选择无交互作用的正交表肠(34)「86](表2一)l，进行液体菌种培养基优化试验。
表2-1正交试验因素与水平
1.2.3液体菌种发酵条件的优化
1..23.1初始pH对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响试验
以优化的培养基配方配制培养基，灭菌前用1mol几Hcl和1mo比Na0H调节pH值至4.5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和自然状态(5.64)，测定不同pH对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响
1.2.3.2不同装液量对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响试验
在优化培养基及适宜pH下，25omL三角瓶中装液量分别为60mL、80mL、10m0L、120mL、140mL，探讨装液量对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖影响。
1.2.3.3液体菌种培养的动态研究试验
在第4d、6d、sd、lod、12d、14d测定灵芝菌丝体生物量、pH、总糖、多糖、还原糖的变化。1.2.3.4种龄和接种量对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响试验
种龄设4d、6d、8d3水平，接种量设5%、10%、15%、20%4水平，观察接种量和种龄对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响。
1.2.4深层发酵条件的优化
1.2.4.1深层发酵培养的动态性研究试验
深层发酵培养基与液体菌种培养基相同，以液体菌种为d6种龄和10%接种量接种到深层发酵培养基中，分别培养ld、Zd、3d、4d、sd、6d、7d、sd 、gd钡组定各项指标。
1.2.4.2搅拌转速对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响试验
设搅拌转速为12oprm、150印m、180prm、210印m，观察对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响。矛
1.2.4.3分散剂对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响试验
以玻璃珠作为分散剂，设分散剂为5粒、10粒、15粒、20粒，观察对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响。
1.2.4.4消沫剂对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响试验
以豆油为消沫剂，分别添加0.10%、.020%、.030%、.040%，观察对灵芝菌丝体生物量及发酵液多糖的影响。
1.2.5发酵罐培养研究
以种龄d610%的接种量接种于SL发酵罐装液量为ZL的培养基中，添加适宜消沫剂，观察灵芝菌丝体在发酵罐中生长的动态。
1.3测定方法
1.3.1菌丝体收集发酵液经两层纱布过滤，菌丝体经蒸馏水冲洗数次后，取菌丝于60℃干燥至恒重，电子天平称重菌丝体干重。
1.3.2pH测定用pH3一2型酸度计测定。
1.3.3多糖和总糖测定蕙酮一硫酸法18刀。
1.3.4还原糖测定DNS法[8gl
1.3.5氨基氮测定甲醛滴定法[99]。
1.3.6发酵液多糖的提取[56]发酵液于4000/r而n离心10而n，取上清液lmL，加2倍体积的95%乙醇，放入冰箱中醇析24h，得乳白色絮状沉淀，乙醇洗涤两次，干燥得灵芝发酵液多糖。
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